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ELISA样本的怎么收集?

更新时间:2024-05-13      浏览次数:113

关于ELISA样本的收集!

一般来说,由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量,因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性, -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测,4℃保存的样本在一周内完成检测。此外,样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3,否则会造成假阴性结果。

可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里,我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

一、液体样本

液体样本处理原则:所有的液体样本,用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)

1、血清:血清是ELISA实验常用的样本,其预处也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本,,将试管或离心管在室内温度下放置自然凝固(视室温环境10分钟到2小时不等)或4℃过夜,分离出血清,(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清能更大程度的分离出来,),2-6℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,立即进行测定,建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

注意事项:在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质,这种情况下,ELISA实验中将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确,出现假阳性结果。另外,样本还应避免细菌污染,因为细菌可能含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。

2、血浆:应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠、枸橼酸纳或柠檬酸钠作为抗凝剂,使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,混合10-20分钟后,2-6℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清液(血浆),建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

注意事项:检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书,查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3、尿液:用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

4、细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。将细胞培养上清液吸入离心管中并以2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),除去细胞碎片和杂质,收集上清液备用,样本保存在-20℃或-80℃,避免反复冻融,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5、脑脊液:用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。((采集大鼠脑脊液)的方法:采集脑脊液时,用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤,剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1. 5cm左右),在其中点向尾侧沿皮下剪开2cm,将皮分离两侧,扩大视野。紧贴大鼠头骨依次逐层剪切各肌层,并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意,有出血时用干纱布按压止血,保持术口清晰。接近颈后黄韧带时,小心地用7号注射针头分离附盖的肌肉,暴露寰枕膜。用1ml注射器(针头用止血钳使针尖与针体成150度钝角),针斜面向上,针近水平刺入蛛网膜下腔,固定针体,缓慢抽取脑脊液,一般采集量为100-200微升。)

6、唾液:用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

二、固体样本

固体样本处理原则:称取1g的固体样本,用9g的合适缓冲液溶解,分泌蛋白可以直接离心取上清检测,细胞内的蛋白,要先收集细胞,再用合适方法破碎,离心取上清测试。

1、组织标本:切割标本后,称取1g组织,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清。分装一份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。对于植物组织,不好匀浆的话,就在液氮中充分研磨。

2、细胞内蛋白样本

许多待测蛋白不是分泌蛋白,而是存在于细胞内的蛋白,这个时候,要先收集细胞,洗涤干净,再破碎细胞,离心取上清。

(1)培养的细胞

A、动物细胞:用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液,使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融(如果反复冻融,破碎效果不好,就采用超声波破碎),以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

B、植物细胞:用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液,使细胞浓度达到100万/ml左右,置于冰盒上,用超声破碎仪,设置破碎2s,冷却30s的方式,充分破碎细胞,以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

(2)组织的细胞

切割标本后,称取1g组织,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

细胞反复冻融方法

1) 吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

2) 将细胞悬浮液收集到离心管中,以1000×g离心10分钟,然后吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次。

3) 加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。在6孔培养板中,每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。

4) 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复冻融过程数次,直至细胞裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

5) 4℃下以10,000×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液, -20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

3、土壤:称取1g土壤,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清。分装一份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。如果是测分泌蛋白,直接取上清检测,测试细胞内蛋白,要破碎细胞。

三、植物

1、标本的精采集及保存

取0.1g(误差±3%以内)新鲜植物组织样本,在液氮中充分研磨;加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20℃过夜;于4℃,8000rpm,离心1小时,取上清;上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是: 80%甲醇(1ml)平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%乙mi(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干,保存备用;上样前加入pH7.4 PBS缓冲液(1ml定容)。混匀后室温放置30分钟,然后4℃离心(8000rpm,15分钟),取上清并暂时保存于4℃待用。

2、植物标本中相关酶或蛋白的测定:(粗提取)

新鲜植物组织请在液氮中充分研磨;加入样品体积9倍的提取液(pH 7.4 PBS缓冲液),请于4℃,8000rpm,离心30分钟,取上清并暂时保存于4℃待用。

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